Spektrofotometer UV-Vis adalah instrumen penting di banyak laboratorium. Untuk memastikan data yang dihasilkan akurat dan dapat diandalkan, instrumen ini perlu diuji kinerjanya secara berkala. Dua parameter utama yang diuji adalah panjang gelombang dan fotometrik (absorbansi/transmisi).
Uji Kinerja Panjang Gelombang
Pengukuran panjang gelombang sangat krusial karena akurasi posisi puncak serapan dapat mempengaruhi perhitungan konsentrasi. Kesalahan pada kalibrasi panjang gelombang akan menghasilkan nilai absorbansi yang tidak tepat.
Prosedur Uji
Uji ini dilakukan dengan menggunakan zat standar yang memiliki puncak absorbansi pada panjang gelombang tertentu yang telah diketahui secara pasti. Contoh bahan standar yang umum digunakan adalah:
- Holmium Oksida (Ho2O3): Larutan holmium oksida atau filter kaca holmium oksida memiliki puncak absorbansi tajam dan stabil di seluruh rentang UV-Vis. Puncak-puncak serapan yang sering digunakan untuk kalibrasi antara lain pada panjang gelombang sekitar 241.5 nm, 287.5 nm, 360.8 nm, 416.3 nm, 453.4 nm, 536.2 nm, dan 640.5 nm.
- Deuterium (D2) atau Gas Hidrogen (H2): Lampu deuterium, yang biasanya digunakan sebagai sumber cahaya di rentang UV, memiliki garis emisi yang tajam. Garis emisi ini dapat digunakan untuk mengkalibrasi panjang gelombang di area UV. Misalnya, garis emisi pada 656.1 nm, 486.0 nm, dan 434.0 nm.
Evaluasi
Setelah mengukur spektrum dari bahan standar, puncak absorbansi yang terukur pada instrumen dibandingkan dengan nilai referensi yang diketahui. Penyimpangan (deviasi) antara nilai terukur dan nilai referensi harus berada dalam batas toleransi yang ditetapkan oleh standar, seperti USP (United States Pharmacopeia) atau EP (European Pharmacopoeia). Misalnya, toleransi biasanya kurang dari ±1 nm pada rentang UV dan ±2 nm pada rentang Vis. Jika penyimpangan melebihi batas, spektrofotometer perlu dikalibrasi ulang.
Uji Kinerja Fotometrik (Absorbansi dan Transmisi)
Uji fotometrik memastikan bahwa instrumen mengukur nilai absorbansi atau transmisi secara akurat dan linier. Akurasi ini sangat penting untuk penentuan konsentrasi sampel berdasarkan Hukum Lambert-Beer.
Prosedur Uji
Pengujian ini menggunakan larutan standar yang memiliki absorbansi diketahui. Bahan standar yang sering digunakan adalah:
- Kalium Dikromat (K2Cr2O7): Larutan kalium dikromat dalam asam perklorat atau asam sulfat adalah standar yang sangat umum. Larutan ini memiliki beberapa puncak absorbansi yang stabil pada 235 nm, 257 nm, 313 nm, dan 350 nm. Absorbansi pada panjang gelombang 257 nm sering digunakan untuk verifikasi.
- Filter Kaca Netral (Neutral Density Filter): Filter ini memberikan nilai absorbansi konstan pada rentang panjang gelombang yang luas. Filter ini berguna untuk memverifikasi akurasi pada berbagai tingkat absorbansi.
Evaluasi
Pengukuran dilakukan pada beberapa konsentrasi atau absorbansi yang berbeda untuk menguji linieritas respons instrumen. Nilai absorbansi yang diukur kemudian dibandingkan dengan nilai referensi yang telah ditetapkan. Hasil uji ini dievaluasi berdasarkan:
- Akurasi Absorbansi: Selisih antara nilai absorbansi yang diukur dan nilai referensi harus berada dalam batas toleransi. Misalnya, standar USP menetapkan toleransi sekitar ±1% pada nilai absorbansi 0.5 A.
- Linieritas: Hubungan antara absorbansi dan konsentrasi (atau absorbansi dan nilai referensi) harus linier dalam rentang yang diuji.
Faktor Lain
Selain uji panjang gelombang dan fotometrik, ada beberapa parameter lain yang dapat diuji untuk memastikan kinerja optimal, seperti:
- Cahaya Liar (Stray Light): Cahaya yang mencapai detektor tanpa melewati sampel. Uji ini biasanya dilakukan dengan larutan KCl atau NaNO2. Nilai absorbansi yang rendah pada panjang gelombang di mana seharusnya tidak ada serapan menunjukkan tingkat cahaya liar yang rendah, yang merupakan indikator instrumen yang baik.
- Resolusi Spektral (Spectral Resolution): Kemampuan instrumen untuk membedakan dua puncak absorbansi yang berdekatan. Uji ini dilakukan dengan menggunakan bahan standar seperti larutan toluena dalam heksana.
Pengujian kinerja spektrofotometer secara rutin adalah langkah wajib dalam praktik laboratorium yang baik (Good Laboratory Practices/GLP) untuk memastikan keandalan data analitik. Hasil pengujian ini harus didokumentasikan dengan baik sebagai bagian dari validasi instrumen.
